W 2013 roku po raz pierwszy w historii w laboratorium powstał syntetyczny hamburger. Wyprodukowanie jadalnego mięsa z bydlęcych komórek macierzystych w ramach „projektu produkcji mięsa w warunkach in vitro” skłania do ponownego przemyślenia sposobu, w jaki produkujemy i przygotowujemy żywność, a dodatkowo zapewnia kluczowy pierwszy krok w tworzeniu zrównoważonej metody produkcji mięsa. Aby osiągnąć ten cel, zespół na Uniwersytecie w Maastricht w Holandii musiał zadbać o to, aby wyposażenie laboratoriów, a w szczególności systemy inkubacji, odpowiadało ich pionierskim standardom.
Żywność przyszłości
Potrzeba opracowania alternatywnych technik produkcji mięsa staje się coraz bardziej nagląca. W badaniu przeprowadzonym w 2006 roku przez Organizację Narodów Zjednoczonych do spraw Wyżywienia i Rolnictwa oszacowano, że 70% wszystkich terenów rolniczych oraz około 30% powierzchni Ziemi jest obecnie przeznaczonych na produkcję zwierzęcą w celu zaspokojenia potrzeb siedmiu miliardów ludzi. Organizacja Narodów Zjednoczonych do spraw Wyżywienia i Rolnictwa twierdzi, że do 2050 roku [1] ogólnoświatowe zapotrzebowanie na mięso w przybliżeniu wzrośnie o ponad dwie trzecie w związku z faktem, że szacowana liczba ludzi na świecie wyniesie 9 miliardów.
W miarę wzrostu liczby ludności i popytu na produkty rolne, częściowo spowodowanego szybkim rozwojem gospodarczym w Afryce i na Bliskim Wschodzie [2], tradycyjne metody produkcji mięsa stają się coraz bardziej niezrównoważone. Hodowla bydła do produkcji mięsa wymaga dużych nakładów, zarówno pod względem finansowym, jak i zasobów naturalnych. Przykładowo do wyprodukowania 1 kg mięsa potrzeba około 15 000 litrów wody [3]. Była to jedna z kwestii, które skłoniły do podjęcia badań na Uniwersytecie w Maastricht.
W październiku 2011 r. zespół kierowany przez profesora Marka Posta oraz techników laboratoryjnych Anona van Essena i Sanne Verbruggen rozpoczął „projekt produkcji mięsa w warunkach in vitro”. Ostatecznym celem projektu było stworzenie jadalnego mięsa w postaci hamburgera bez bezpośredniego wykorzystania tkanki bydlęcej. W ten sposób produkcja w przyszłości może stać się bardziej zrównoważona i wydajna. Był to wyjątkowy projekt, który według wiedzy Uniwersytetu nie był powielany nigdzie indziej na świecie.
Tworzenie hamburgera
Hamburger został po raz pierwszy zaprezentowany, ugotowany i zjedzony 5 sierpnia 2013 r. w Londynie, a to wydarzenie poprzedzały miesiące ciężkiej pracy. Stworzenie samego fizycznego hamburgera zajęło trzy miesiące. W trakcie produkcji pozyskano komórki macierzyste (satelitarne) z próbki tkanki mięśniowej pobranej z łopatki krowy. Te komórki są często określane mianem mioblastów (komórek mięśniowych) w stanie spoczynku i chociaż odgrywają kluczową rolę podczas naprawy i utrzymywania tkanki mięśniowej w organizmie, mają bardzo ograniczoną zdolność do rozmnażania. Jednak komórki satelitarne można aktywować, wystawiając je na działanie bodźca, na przykład uszkodzenia lub dużego obciążenia mechanicznego. Z oryginalnych próbek wyhodowano miliardy komórek.
Komórki mioblastów naturalnie łączą się ze sobą w procesie określanym mianem miogenezy — powstawania tkanki mięśniowej — obserwowanego w szczególności w trakcie rozwoju embrionalnego. W trakcie tego procesu komórki łączą się w wielojądrowe włókna określane mianem miotub w celu utworzenia tkanki mięśniowej. Mioblasty zostały umieszczone wokół okrągłych żelowych rdzeni, co doprowadziło do powstania pierścieni z tkanki. Kurczenie i rozluźnianie tych komórek powodowało wzrost ich masy. Na końcu 20 000 pierścieni połączono starannie ze sobą w celu utworzenia ostatecznego hamburgera.
Ta metoda w istotnym stopniu była uzależniona od pomyślnej inkubacji oraz wzrostu silnych i zdrowych komórek, dlatego też konieczne było uważne przemyślenie dokładnych wymagań, jakie musiał spełniać system inkubacji. Tylko w ten sposób zespół Uniwersytetu w Maastricht mógł mieć pewność uzyskania możliwie najlepszego produktu końcowego.
Gwarancja linii komórkowych o dobrej jakości
Początkową kwestią, która była rozważana podczas dokonywania wyboru inkubatorów na potrzeby projektu produkcji mięsa w warunkach in vitro, była objętość hodowli komórkowych. Duża ilość oznaczała, że inkubatory musiały być w stanie pomieścić dużą liczbę próbek bez jakiegokolwiek uszczerbku dla niezawodności i bezpieczeństwa. Ponadto komórki hodowano przy użyciu 10-warstwowych butelek, które były bardzo ciężkie, a więc solidna konstrukcja inkubatorów miała kluczowe znaczenie.
Dla wydajnej inkubacji kluczowe znaczenie miała również kontrola parametrów otoczenia i temperatury. Optymalnym środowiskiem dla wzrostu komórek macierzystych jest to, które najbardziej przypomina środowisko naturalne w organizmie. W przypadku komórek macierzystych mięśni oznacza to stale niskie stężenie tlenu oraz wysokie stężenie dwutlenku węgla (3% O2, 5% CO2) i stabilną temperaturę wynoszącą około 37˚C. Te warunki zwiększają zdolność do proliferacji komórek satelitarnych w porównaniu ze standardowymi warunkami hodowli komórkowych przy stężeniu tlenu wynoszącym 21%, gdyż bliżej odpowiadają stężeniom tlenu w warunkach in vivo, w nienaruszonym włóknie mięśniowym [4]. Na hodowle komórkowe wpływ wywierają również wahania temperatury, a konsekwencje ich występowania obejmują od całkowitego niepowodzenia hodowli komórkowej do ekspresji nieprawidłowego fenotypu i zmiany metabolizmu komórek [5]. Z tego powodu konieczne było utrzymanie ścisłej kontroli, gdyż hodowle komórkowe wystawione na wahania temperatury nie byłyby odpowiednie dla projektu.
Dodatkowo w przypadku izolacji komórek satelitarnych od zwierząt istniało niewielkie ryzyko wystąpienia zanieczyszczeń w próbce wyjściowej. Konieczne było wyeliminowanie jakiejkolwiek możliwości przeniesienia zanieczyszczeń do hodowanej linii komórkowej w celu zagwarantowania pomyślnego utworzenia hamburgera i jego bezpieczeństwa. W związku z tym kluczowe znaczenie miały wiarygodne systemy odkażania w inkubatorach. W przypadku niepowodzenia odkażania konieczne byłoby rozpoczęcie całego procesu od początku. Ponieważ wyprodukowanie fizycznego hamburgera zajęło 3 miesiące, wiązałoby się to z ogromnymi obciążeniami finansowymi i czasowymi dla zespołu.
Te trzy kwestie — pojemność, kontrola i odkażanie — stanowiły główne czynniki uwzględniane podczas podejmowania decyzji dotyczącej urządzeń do produkcji hamburgerów. Wybrany system inkubacji, wyprodukowany przez firmę PHCbi, obejmował kilka technologii gwarantujących wymagane poziomy jakości i kontroli.
Pojemność, kontrola i odkażanie
Zespół od ostatnich dziesięciu lat korzystał z inkubatorów firmy PHCbi bez jakichkolwiek problemów, a to pozytywne doświadczenie skłoniło go do rozważenia zakupu podobnego sprzętu na potrzeby tego pionierskiego projektu. Dzięki pozyskaniu doświadczonego dostawcy systemów inkubacji zespół „projektu produkcji mięsa w warunkach in vitro” był w stanie wdrożyć specjalistyczną technologię i wiedzę w celu sprostania wymaganiom tego projektu. Szeroka gama oferowanych inkubatorów sprawiła, że nie było problemu przy wyborze modelu, który był w stanie pomieścić dużą liczbę wymaganych linii komórkowych. Po poczynieniu tych ustaleń konieczne było określenie odpowiedniej technologii, która mogła zapewnić wymagane poziomy kontroli parametrów środowiska i odkażania.
W przypadku hodowli komórek macierzystych szczególne znaczenie miało uważne monitorowanie i kontrolowanie stężenia O2. Na uniwersytecie w Maastricht ten poziom kontroli zapewnił cyrkonowy czujnik tlenu o długiej żywotności, który został zaprojektowany w celu utrzymywania niższych od obecnych w otoczeniu stężeń tlenu mieszczących się w zakresie 1–18%. Dodatkowo elektroniczne regulatory PID zapewniały wysoką dokładność, ponieważ utrzymywały nastawy temperatury i gazu w całym systemie.
Niezawodną regulację temperatury zapewniał opatentowany system Direct Heat and Air Jacket w połączeniu z izolacją z pianki o wysokiej gęstości oraz konstrukcją inkubatora. Jak wykazano, ten system chroni przed kondensacją i pomaga zmniejszyć wpływ wahań temperatury otoczenia na komorę wewnętrzną. Delikatna cyrkulacja powietrza uzyskiwana za pomocą wentylatora zapewnia jednorodne temperatury dla wszystkich hodowli w komorze niezależnie od ich pozycji — była to duża zaleta podczas tego projektu, w ramach którego jednocześnie hodowano tysiące poszczególnych próbek.
Konieczne było również zastosowanie systemów odkażania w celu zabezpieczenia linii komórkowych. W tym celu podczas tworzenia syntetycznego hamburgera zespół skorzystał z dwóch rodzajów inkubatorów firmy PHCbi. Pierwszy był wykorzystywany wyłącznie do izolacji i odkażania — po tych etapach wyizolowane komórki były przenoszone do drugiego inkubatora w celu prowadzenia hodowli.
Takie postępowanie zmniejszało ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, gdyż linie komórkowe poddawane hodowli nie były narażone na potencjalne substancje zanieczyszczające z wyjściowej próbki tkanki mięśniowej.
W celu wyeliminowania i usunięcia wszelkich zanieczyszczeń przenoszonych drogą powietrzną, które mogły przedostać się do komory, a także usunięcia zanieczyszczeń z misy z wodą, wybrane inkubatory MCO-19M (które zostały zastąpione nowy modelem MCO-170M inkubatorów wielogazowych) były wyposażone w izolowaną, wąskopasmową, bezozonową lampę UV. Jest ona włączana automatycznie na określony czas po każdym otwarciu drzwi inkubatora, co zapewnia dodatkowe bezpieczeństwo komórek w hodowli. Dodatkowo wszystkie powierzchnie we wnętrzu inkubatora są wykonane ze stopu stali nierdzewnej wzbogaconego miedzią InCu-saFe®, który zapewnia stałą ochronę bakteriobójczą, a w połączeniu z lampą UV SafeCell® zapobiega wzrostowi pleśni, grzybów i bakterii.
W celu wyeliminowania ryzyka skażenia ze strony samych inkubatorów uniwersytet w Maastricht podjął decyzję o wyborze opcji odkażania z użyciem H2O2 w celu zapewnienia kompletnego odkażania. Po sprawdzeniu systemu proces ten rozpoczyna się od odparowania nadtlenku wodoru, który następnie jest rozprowadzany przez system przepływu powietrza w całej komorze.
Następnie włączana jest lampa ultrafioletowa (UV), która powoduje rozkład par H2O2 do pary wodnej i tlenu. System ten skraca czas wyłączenia inkubatora z eksploatacji do nie więcej niż trzech godzin w przypadku odkażania całej komory. Jest to rozwiązanie nie tylko szybkie, lecz również łatwe w użyciu, a ponadto pozwala na wyeliminowanie zanieczyszczeń na długi czas po każdym pełnym cyklu odkażania. Dzięki temu systemowi hodowla miotub mogła odbywać się nie tylko bezpiecznie, lecz również bez powtarzających się przerw na czyszczenie i odkażanie, co skutkowało poprawą wydajności projektu.
Dalsze etapy
Zbudowany z pasm mięśni wyhodowanych wyłącznie w laboratorium hamburger został przygotowany poprzez dodanie odrobiny proszku jajecznego, bułki tartej oraz kilku innych składników powszechnie wykorzystywanych w hamburgerach. Hamburger, mimo braku przypraw i tłuszczu, przez co nie był tak soczysty, zdecydowanie miał smak mięsa. Jako pierwszy rozpoznawalny produkt mięsny stworzony przy użyciu tej metody, projekt był istotnym dowodem słuszności koncepcji technik hodowania mięsa w warunkach laboratoryjnych i zapewnił obiecującą alternatywę dla produkcji mięsa w przyszłości.
Nie byłoby to możliwe bez niezawodnego, wydajnego i kontrolowanego systemu inkubacji. Dzięki zastosowaniu specjalistycznej technologii na wysokim poziomie firmy PHCbi „projekt produkcji mięsa w warunkach in vitro” był w stanie stworzyć optymalne środowisko dla hodowanych komórek. W ten sposób 20 000 włókien potrzebnych do utworzenia hamburgera wyprodukowano wydajnie, bezpiecznie i w najlepszej jakości.
Piśmiennictwo
[1] The State of Food and Agriculture: Livestock in the balance. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome, 2009. (http://www.fao.org/docrep/012/i0680e/i0680e.pdf) Accessed 13/12/2013
[2] Developing Countries Dominate World Demand for Agricultural Products, USDA, Aug 2013 (http://www.ers.usda.gov/amber-waves/2013-august/developing-countries-dom...)
[3] 4th edition of the UN World Water Development Report (WWDR4)
[4] Culture in low levels of oxygen enhances in vitro proliferation potential of satellite cells from old skeletal muscles. Chakravarthy MV, Spangenburg EE, Booth FW. Cell Mol Life Sci. 2001 Jul;58(8):1150-8
[5] Introduction to cell and tissue culture [electronic resource]. Jennie P. Mather, Penelope E. Roberts. Springer, 1998
Original article: http://www.labmate-online.com/articles/laboratory-products/3/mr_anon_van...